<<
>>

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Принцип метода. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-PCR) является развитием метода полимеразной цепной реакции. Благодаря применению современного оборудования и реагентов имеется возможность фиксации выхода (накопления) продукта реакции после каждого цикла амплификации.

Это позволяет строить кинетические кривые ПЦР (рис. 4.6).

Практическое применение RT-PCR позволяет как модернизировать применяемые схемы исследования ДНК, так и решать ряд самостоятельных задач. Реализуется метод RT-PCR с помощью специального термоциклера, дополненного системой детекции флуоресцентных сигналов (рис. 4.7).

|?} Pile Viw Tools instrument Analyse Window: Нф

jiamp;a ЙРЙ О

class="lazyload" data-src="/files/uch_group31/uch_pgroup177/uch_uch799/image/29.jpg" alt="" /> Рис. 4.7. Схема детекции флуоресцентных сигналов при RT-PCRTn.estttf-fc |Q лоопао Aato Beeeiwe lt;• tisfatef Baseline gtert(c^da);46 Erd(o^plaV:i1E [ Analyze ~|

Help J tO I It I 12 _

¦ If ¦ Источник света Система линз, I фильтров и зеркал \

:||              Цифровая              камера

I г )

Исследуемые пробы

Рис. 4.7. Схема детекции флуоресцентных сигналов при RT-PCR

При каждом цикле ПЦР свет через оптическую систему возбуждает свечение флуоресцентных красителей, содержащихся в исследуемых пробах.

Источником света в зависимости от используемого оборудования могут являться галогеновые лампы, лазеры. Возбужденное свечение фиксируется цифровой камерой и сохраняется на компьютере. Процесс считывания интенсивности флуоресценции производится после каждого цикла ПЦР для каждой исследуемой пробы ДНК.

Существуют различные варианты проведения ПЦР с флуоресцентными реагентами, позволяющими детектировать накопление продуктов ПЦР.

Наиболее современным методом, обладающим наивысшей чувствительностью и точностью является применение специальных зондов TaqMan. В этом случае после первой фазы ПЦР - денатурации и во время второй фазы - отжига праймеров - к матричной цепи ДНК также присоединяется зонд TaqMan - искусственно созданный олигонуклеотид, который представляет собой короткий фрагмент ДНК, комплементарный участку, синтезируемому при ПЦР (рис. 4.8). Зонд TaqMan содержит две флуоресцентные метки - репортер- ный краситель в 5'-конце (reporter) и гаситель флуоресценции в 3'- конце (quantcher). Эти метки подобраны так, что, когда они рядом - флуоресценция гасится друг другом. Это означает, что при инициации реакции отсутствует флуоресценция исследуемых проб. Начальные измерения детектором соответствуют фоновому сигналу.

При следующей фазе ПЦР - достраивании - роль ДНК- полимеразы оказывается двоякой. Данный фермент удлиняет цепь ДНК, последовательно присоединяя по одному нуклеотиду к 3'- концу, осуществляя синтез в направлении 5-3', и, в то же время, осуществляется его экзонуклеазная активность, в процессе которой разрушается зонд TaqMan. Метки зонда освобождаются, выходят в раствор и восстанавливают способность флуоресцировать. Накопление продуктов ПЦР регистрируется по увеличению флуоресценции репортерного красителя. Увеличение флуоресцентного сигнала происходит только в случае специфичной амплификации определенного участка человеческой ДНК. При этом исключается воз

можность детектирования продуктов неспецифической амплификации и бактериальной ДНК.

3'

5’

Денатурация, отжиг праймеров и зонда TaqMan

3'-

5'-

Достраивание

3'-

Достраивание,

| разрушение зонда TaqMan

''тз

Кинетическую кривую ПЦР получают при построении кривой зависимости возрастания флуоресцентного сигнала от числа циклов ПЦР. Кривая имеет сигмовидную форму. В ней выделяют три области или стадии (рис. 4.9): стадию инициации, когда ПЦР - продукты еще не детектируются, экспоненциальную стадию, когда наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР и стадию насыщения в виде плато.

Использование метода в судебно-генетических исследованиях. В судебно-генетической практике RT-PCR применяют для решения задач по установлению концентрации ДНК человека в исследуемых пробах, установлению ингибиторов ПЦР, а также установления половой принадлежности.

Данные о концентрации ДНК в пробах после ее выделения из исследуемых объектов необходимы для успешного проведения последующих этапов исследования ДНК.

В случае ее недостаточного количества необходимо остановить исследование и повторить этап выделения ДНК. Это позволит сэкономить как время, так и дорогостоящие реагенты, которые могли быть напрасно истрачены. С другой стороны, в случае избыточного выделения ДНК результаты количественной оценки проб ДНК позволят разбавить их до оптимальной концентрации и этим устранить ряд неспецифических явлений, возникающих при исследовании избыточных количеств ДНК. Таким образом, полимеразную цепную реакцию в реальном времени технологически проводят до этапа основной ПЦР.

В результате проведения RT-PCR на первых циклах (от шестого до пятнадцатого) чувствительности детекционного оборудования недостаточно для учета флуоресценции - наблюдаемое свечение называют базовой линией (Baseline). Линия, которая выше базовой линии на 0,2 условных единиц интенсивности флуоресценции, называется пороговой линией (Threshold). Цикл, в котором флуоресцентный сигнал возрастает и происходит пересечение пороговой линии, называется пороговым циклом (Ct).

На его значение влияют как исходная концентрация человеческой ДНК, так и степень эффективности ПЦР.

В ходе исследования определяют пороговые циклы анализируемых проб. Те образцы, в которых концентрация человеческой ДНК больше, быстрее достигают пороговой линии при более низких номерах циклов, чем образцы с меньшей концентрацией.

Для вычисления абсолютной концентрации ДНК исследуемых проб используют калибровочные пробы, для которых концентрация ДНК известна. На основе результатов определения пороговых циклов калибровочных проб строится калибровочный график (Standard Curve) зависимости порогового цикла (Ct) от исходной концентрации ДНК (рис. 4.10). По такому графику можно определить по измеренному значению Ct концентрацию ДНК в неизвестных пробах. При использовании современного оборудования данный учет и определение осуществляется автоматизировано.

Standard Curve

amp;

1

в

в

и

1

s

S

1

~2              -1 50              -1              -0.50              о              0,50              1              .              1.50              . у? ¦

Log СО

Рис. 4.10. Калибровочный график для определения концентрации ДНК

Для реализации возможности установления ингибиторов ПЦР в исследуемых пробах параллельно с ПЦР на матрице человеческой ДНК также происходит ПЦР на матрице синтетической гтоследова-

тельности ДНК, которая не встречается в природе. Для осуществления этой ПЦР в реакционной среде присутствуют два праймера (прямой и обратный) и свой зонд TaqMan, имеющий уже другую флуоресцентную метку - для обнаружения именно этой синтетической последовательности.

Такая вторая ПЦР называется внутренним контролем ПЦР (IPC).

По результатам оценки реакции IPC можно контролировать ПЦР: не были ли допущены ошибки при постановке ПЦР или есть ли в среде ингибиторы ПЦР. Возможны следующие варианты контроля: есть сигнал IPC и сигнал исследуемой ДНК - это норма, ошибок при исполнении не было; есть сигнал IPC, нет сигнала исследуемой ДНК - количества исследуемой ДНК недостаточно для ПЦР. Необходимо повторить выделение ДНК или объект непригоден для исследования; нет сигнала IPC или он слабее, чем в других пробах, нет сигнала исследуемой ДНК - частичное или полное ингибирование ПЦР. Необходимо повторить выделение ДНК или объект непригоден для исследования; нет сигнала IPC или он слабее, чем в других пробах, есть сигнал исследуемой ДНК - наблюдается преимущественная амплификация исследуемой ДНК, вероятнее всего, за счет ее большого количества (сигнал IPC в данном случае игнорируется).

Половая принадлежность исследуемого объекта устанавливается за счет применения дополнительной пол-специфичной системы ПЦР и соответствующего зонда TaqMan, комплементарных последовательностям Y-хромосомы. Исследование проводят параллельно с исследованием по установлению концентрации ДНК человека. Возможны следующие варианты результатов исследования: сигналы исследуемой ДНК и ДНК Y-хромосомы одинаковы это означает, что установлен мужской генетический пол; есть исследуемой ДНК, нет сигнала ДНК Y-хромосомы - установлен женский генетический пол; сигналы исследуемой ДНК и ДНК Y-хромосомы не одинаковы - это означает, что в пробе присутствует смесь ДНК лиц женского и мужского генетического пола.

<< | >>
Источник: И.В. Стороженко, А.Ю. Культин, В.Г. Никитаев, А.Н. Проничев, Е.Ю. Бердникович. Компьютерные технологии в судебно-генетической экспертизе. 2010

Еще по теме Полимеразная цепная реакция в реальном времени:

  1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
  2. Выводы по результатам экспертизы
- Авторское право - Аграрное право - Адвокатура - Административное право - Административный процесс - Акционерное право - Бюджетная система - Горное право‎ - Гражданский процесс - Гражданское право - Гражданское право зарубежных стран - Договорное право - Европейское право‎ - Жилищное право - Законы и кодексы - Избирательное право - Информационное право - Исполнительное производство - История политических учений - Коммерческое право - Конкурсное право - Конституционное право зарубежных стран - Конституционное право России - Криминалистика - Криминалистическая методика - Криминальная психология - Криминология - Международное право - Муниципальное право - Налоговое право - Наследственное право - Нотариат - Образовательное право - Оперативно-розыскная деятельность - Права человека - Право интеллектуальной собственности - Право собственности - Право социального обеспечения - Право юридических лиц - Правовая статистика - Правоведение - Правовое обеспечение профессиональной деятельности - Правоохранительные органы - Предпринимательское право - Прокурорский надзор - Римское право - Семейное право - Социология права - Сравнительное правоведение - Страховое право - Судебная психиатрия - Судебная экспертиза - Судебное дело - Судебные и правоохранительные органы - Таможенное право - Теория и история государства и права - Транспортное право - Трудовое право - Уголовное право - Уголовный процесс - Философия права - Финансовое право - Экологическое право‎ - Ювенальное право - Юридическая антропология‎ - Юридическая периодика и сборники - Юридическая техника - Юридическая этика -