<<
>>

Полимеразная цепная реакция

Метод ПЦР. Следующий этап исследования - проведение амплификации изучаемых полиморфных последовательностей ядерной ДНК методом полимеразной цепной реакции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР или PCR от Polymerase chain reaction) представляет собой процесс контролируемого синтеза ДНК, позволяющий амплифицировать (копировать) интересующие последовательности ДНК.

Метод копирования ДНК посредством ПЦР был открыт в 1985 г. Кэри Мюлли- сом, сотрудником одной из биотехнологических компаний. За изобретение метода Кэри Мюллис в 1993 г. получил Нобелевскую премию по химии.

Процесс амплификации аналогичен процессу воспроизведения ДНК, который происходит в клетке перед ее делением, с тем лишь отличием, что копируется не вся хромосома, а лишь только ее короткий фрагмент.

ПЦР является циклическим процессом, осуществляемым при участии ДНК- полимеразы и обеспечивающим копирование уже имеющейся последовательности ДНК. В процессе реакции данная последовательность накапливается экспоненциально, и к концу реакции ее количество измеряется миллионами копий.

Границы копируемого участка ДНК определяются двумя праймерами - короткими синтетическими последовательностями одно- нитевой ДНК, комплементарными 3'-концам интересующей последовательности ДНК.

Фазы цикла амплификации. Цикл амплификации состоит из трех фаз: денатурации, отжига и достраивания, различающихся температурой (рис. 4.4).

Денатурация, отжиг праймеров

—м

Достраивание

              —

Денатурация,

отжиг праймеров

/> Рис.<div class=
4.4. Схема первых грех циклов ТПДР. После каждого цикла количество ДНК с заданной последовательностью удваивается" />

Достраивание

Продукты второго цикла

Денатурация, отжиг, достраивание

gt;- Продукты третьего цикла

3'- 5~

Рис. 4.4. Схема первых грех циклов ТПДР. После каждого цикла количество ДНК с заданной последовательностью удваивается

В первой фазе под действием высокой температуры (около 94- 95 °С) происходит полная денатурация (разделение комплементарных цепей) матричной (исследуемой) ДНК с образованием одноцепочечных молекул.

Во второй фазе температура снижается и происходит отжиг праймеров на комплементарных им участках матричной ДНК.

Температура, которая требуется для отжига праймеров, зависит от состава оснований праймеров и обычно составляет 50-70 °С. Разработчики реагентов стремятся чтобы системы праймеров характеризовались относительно высокой температурой отжига. При более низкой температуре может происходить ренатурация исходной матричной ДНК и появление неспецифических продуктов реакции.

В период третьей фазы с участием ДНК-полимеразы происходит синтез или достраивание цепи, комплементарной матричной. Температура обычно варьируется в диапазоне 70-75 °С.

В результате при оптимальных условиях к концу цикла количество ДНК с заданной последовательностью удваивается.

В следующих циклах температурные фазы повторяются, при этом в качестве матричной ДНК служат не только исходные молекулы ДНК, но и те цепи, которые были синтезированы в предыдущих циклах. Теоретически, к концу 30-го цикла амплификации на основе одной молекулы ДНК синтезируется до 109 копий интересующей последовательности.

На первоначальных этапах применения метода ПЦР в качестве полимеразы использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Е. Coli. Поскольку этот фермент разрушался при температуре денатурации ДНК, его необходимо было добавлять в каждом цикле на этапе достраивания цепи. Этот недостаток был преодолен после выделения из бактерии Termus aquaticus, обитающей в горячих источниках при температуре 70-75 °С, термостабильной ДНК- полимеразы (Taq-ДНК-полимеразы).

Использование этой полимеразы при ПЦР позволило автоматизировать процесс амплификации, используя простой робот, называемый термоциклером или амплификатором.

Изобретение ПЦР и ее автоматизация повсеместно признано одним из самых основных прорывов в истории технологий исследования ДНК. Этот метод копирования ДНК оказался практически незаменимым в большинстве биотехнологических приложениях.

Широко применяют ПЦР и в судебно-генетической экспертизе. Именно ПЦР определяет высокую чувствительность криминалистического анализа ДНК.

Постановка ПЦР. При постановке ПЦР суммарную клеточную ДНК человека вводят в реакционную смесь, содержащую необходимые компоненты для работы термостабильной ДНК-полимеразы (7Ъд-ДНК-полимеразы). Матрицей для амплификации исследуемых участков STR-локусов ДНК служат молекулы ядерной ДНК исследуемого индивида. Специфическим компонентом реакции и амплификационной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные праймеры, определяющие, какой STR- локус будет избирательно синтезироваться в ходе реакции. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез новых полинук- леотидных цепей с помощью ДНК-полимеразы осуществляется только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК

ДНК-амплификатор обеспечивает необходимый температурный профиль реакции, параметры которого — продолжительность и температура каждой стадии ПЦР зависят от структуры используемых праймеров и потому индивидуальны для каждой конкретной амплификационной индивидуализирующей системы (табл. 4.1).

Таблица 4.1

Пример температурного профиля ПЦР, используемого для синтеза STR-локусов

Инициали

зирующая

инкубация

Денату

рация

Отжиг

праймеров

Достраи

вание

Заключи

тельное

достраива

ние

Заключи

тельная

инкубация

28 циклов

95 °С

94 °С

59 °С

72 °С

60 °С

4 °С

11 мин

1 мин

1 мин

1 мин

60 мин

оо

При исследовании STR-локусов при ПЦР синтезируются фрагменты, длина которых зависит от числа повторяющихся единиц в конкретном локусе.

В случае исследования гомозиготного образца образуется один вид фрагментов, а в случае гетерозиготного - два. Общая длина синтезируемых фрагментов складывается из величины собственно

полиморфного участка, а также последовательностей, ограниченных праймерами и располагающихся по его флангам (рис. 4.5). Варьируя величиной этих последовательностей при подборе последовательностей праймеров, имеется возможность в итоге получать различные размеры продуктов ПЦР.

Полиморфный участок

Последовательности ограниченные праймерами и располагающиеся по флангам полиморфного участка

Рис. 4.5. Схема последовательностей ДНК, синтезируемых при типировании STR-локусов

Современные амплификационные системы. Одновременное использование нескольких амплификационных систем праймеров, различающихся размерами продуктов ПЦР обеспечивает возможность создания мультиплексных систем, позволяющих проводить исследование нескольких STR-локусов за один цикл исследования. Те же возможности обеспечивает использование различных флуоресцентных меток. В применяемых амплификационных системах праймеров один из праймеров несет флуоресцентную метку, которая в результате ПЦР встраивается в продукты реакции. Это позволяет осуществить в дальнейшем автоматизированную детекцию продуктов ПЦР. При одновременном использовании нескольких амплификационных систем праймеров, различающихся флуоресцентными метками появляется возможность различать продукты ПЦР разных локусов независимо от их величины.

В современных наборах для типирования STR-локусов ДНК человека применяют оба варианта создания мультиплексных систем, что позволяет типировать в рамках одного цикла исследования порядка 16 STR-локусов и более.

Следует отметить, что температурный профиль ПЦР зависит от структуры используемых праймеров и индивидуален для каждой конкретной системы праймеров. Для создания и оптимизации

мультиплексных систем анализа ДНК необходим тщательный подбор систем праймеров со сходными условиями ПЦР. Очевидно, что подобные задачи невозможно решить без соответствующего компьютерного моделирования.

Применение мультиплексных систем определяет высокие требования к специфичности процесса ПЦР. Неконтролируемый синтез ДНК, который может происходить при подготовке ПЦР, приводит к возникновению неспецифических продуктов реакции, затрудняющих дальнейшую интерпретацию результатов.

В современных амплификационных системах реализован так называемый «горячий старт», который достигается использованием инактивированной термостабильной ДНК-полимеразы. Данная полимераза лишена полимеразной активности и при подготовке ПЦР неконтролируемого синтеза ДНК не происходит. При проведении ПЦР в режим амплификации вводят дополнительную инкубацию при 95 °С для разрушения комплекса антиген-антитело и восстановления у полимеразы ее полимеразной активности. Последующие этапы ПЦР проводят при высоких температурах, что обеспечивает ее специфичность.

Другой особенностью проведения ПЦР мультиплексных систем, повышающей специфичность процесса, является введение в режим амплификации заключительной инкубации при 60°С. В процессе синтеза ДНК при завершении матричной цепи для ДНК- полимеразы характерно встраивание одного «лишнего» нуклеотида. Эффективность такого встраивания зависит от ряда факторов, что в итоге приводит к присутствию среди продуктов ПЦР фрагментов как с «лишним» нуклеотидом (N+1 -фрагменты), так и без него (N-фрагменты). В результате заключительной инкубации при 60 °С происходит достройка к синтезированным продуктам ПЦР одного дополнительного нуклеотида и устранение неспецифических N-фрагментов.

Новым вариантом исследования STR-локусов является применение амплификационных систем типа «мини STR». В таких системах укорочены последовательности, располагающиеся по флангам полиморфного участка. В результате общая величина продуктов ПЦР уменьшена так, что не превышает 200 п.н. Применение

таких систем способствует более вероятному получению результата при исследовании проб, содержащих деградированную ДНК.

Однако у амплификационных систем типа «мини STR» имеются недостатки, которые не позволяют их применять для массовых исследований. При уменьшении последовательностей, располагающихся по флангам полиморфного участка, изменяется и область прикрепления праймеров, которая оказывается вне кодирующих участков ДНК. В этих местах вероятность мутационных точковых замен, инсерций и делеций выше, чем в кодирующих участках ДНК.

В результате на исследуемой матричной ДНК может не оказаться последовательности, полностью комплементарной последовательности праймерам, что приведет к сбою ПЦР, или величина синтезируемой последовательности окажется иной по сравнению с обычными амплификационными системами. В итоге повышается вероятность ложного заключения о гомозиготности образца ДНК, на самом деле являющегося гетерозиготным, имеющего во втором аллеле мутационные замены в области прикрепления праймеров, или установления неверного генотипа. Вероятность таких мутаций может достигать 0,005, что соответствует ложному генотипирова- нию (при исследовании одного локуса) в одном из 200 случаев. 

<< | >>
Источник: И.В. Стороженко, А.Ю. Культин, В.Г. Никитаев, А.Н. Проничев, Е.Ю. Бердникович. Компьютерные технологии в судебно-генетической экспертизе. 2010

Еще по теме Полимеразная цепная реакция:

  1. Технологическая схема исследования ядерной ДНК
  2. Полимеразная цепная реакция
  3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
  4. Выводы по результатам экспертизы
  5. Основные этапы исследования мтДНК
- Авторское право - Аграрное право - Адвокатура - Административное право - Административный процесс - Акционерное право - Бюджетная система - Горное право‎ - Гражданский процесс - Гражданское право - Гражданское право зарубежных стран - Договорное право - Европейское право‎ - Жилищное право - Законы и кодексы - Избирательное право - Информационное право - Исполнительное производство - История политических учений - Коммерческое право - Конкурсное право - Конституционное право зарубежных стран - Конституционное право России - Криминалистика - Криминалистическая методика - Криминальная психология - Криминология - Международное право - Муниципальное право - Налоговое право - Наследственное право - Нотариат - Образовательное право - Оперативно-розыскная деятельность - Права человека - Право интеллектуальной собственности - Право собственности - Право социального обеспечения - Право юридических лиц - Правовая статистика - Правоведение - Правовое обеспечение профессиональной деятельности - Правоохранительные органы - Предпринимательское право - Прокурорский надзор - Римское право - Семейное право - Социология права - Сравнительное правоведение - Страховое право - Судебная психиатрия - Судебная экспертиза - Судебное дело - Судебные и правоохранительные органы - Таможенное право - Теория и история государства и права - Транспортное право - Трудовое право - Уголовное право - Уголовный процесс - Философия права - Финансовое право - Экологическое право‎ - Ювенальное право - Юридическая антропология‎ - Юридическая периодика и сборники - Юридическая техника - Юридическая этика -
- Бизнес, предпринимательство - Военное дело - Гуманитарные науки - Исторические науки - Маркетинг, реклама и торговля - Медицина - Менеджмент - Политология - Психологические дисциплины - Социология - Экологические дисциплины - Экономические науки - Юридические науки -