Основные методы исследования ДНК

Для исследования локусов, обладающих полиморфизмом нуклеотидной последовательности, обычно применяют метод гибридизации с аллель-специфичными зондами. Для создания таких зондов должна быть определена нуклеотидная последовательность всех аллелей.

Процессы синтеза аллель-специфичных зондов и оптимизации условий гибридизации являются сложными и дорогостоящими. Это является существенным недостатком исследования уникальных последовательностей в криминалистическом ДНК-анализе.

Исследование полиморфизма нуклеотидной последовательности путем непосредственной расшифровки изучаемых последовательностей (т.е. методом секвенирования) также имеет ряд сложностей (например, при исследовании гетерозиготного образца ДНК, содержащего смесь двух различных последовательностей ДНК). Перед этапом секвенирования ДНК последовательности каждого аллеля должны быть выделены из смеси ДНК образца, что бывает нелегко выполнить на практике.

Указанные недостатки сужают возможности использования локусов уникальных последовательностей в криминалистическом ДНК-анализе, поэтому направление по их исследованию в настоящее время не является перспективным.

Участки высокоповторяющейся ДНК организованы в геноме в виде тандема многократно повторяющихся коротких последова

тельностей, т.е. тандемных повторов, которые могут быть идентичны или близки по строению.

Участки тандемных повторов обладают высоким уровнем полиморфизма, основой которого является непостоянство числа повторяющихся единиц, что обусловливает различия в длине аллелей одного локуса. Такой вид полиморфизма называют полиморфизмом длины.

Локусы тандемных повторов разделяют на две группы: мини- сателлитных, или VNTR-локусов (Variable Number Tandem Repeat локус с переменным числом тандемных повторов) с длиной повтора семь и более пар нуклеотидов, и микросателлитных, или STR-локусов (Short Tandem Repeat - локус с короткими тандемными повторами) с длиной повтора от двух до шести пар нуклеотидов.

Интервал длин аллелей VNTR-локусов составляет от 200 до ООО п.н. Большинство этих локусов обладает высоким полиморфизмом (например, у локуса D1S80 встречается более 20 аллелей) и соответственно высокими индивидуализирующими свойствами.

Однако в случае исследования ДНК, подвергшейся деградации (разрушению), что очень часто встречается в экспертной практике, им свойственны два существенных недостатка. Во-первых, из-за высокой вероятности деградации аллелей, связанной с их относительно большой величиной, может вообще оказаться невозможным установить аллельную характеристику ДНК. Во-вторых, из-за большой разницы в длине аллелей существует вероятность выявить только один низкомолекулярный аллель и дать ложное заключение о гомозиготности образца ДНК, на самом деле являющегося гетерозиготным, у которого высокомолекулярный аллель подвергся большей деградации. Эти недостатки ограничивают использование VNTR-локусов, и поэтому в настоящее время направление по их исследованию практически не развивается.

STR-локусы лишены недостатков, свойственных минисател- литным локусам. Интервал длин аллелей составляет от 100 до 300 п.н., что значительно увеличивает вероятность их сохранения в деградированной ДНК и гарантирует выявление всех аллелей в ге

терозиготных образцах. По сравнению с VNTR-локусами, STR- локусы обладают меньшим полиморфизмом, однако этот недостаток легко преодолевается за счет возможности проведения анализа сразу нескольких локусов в рамках одного цикла исследования. Кроме того, данная возможность позволяет сократить сроки исследования и повысить его чувствительность (исходя из одного и того же количества ДНК, установить не один, а сразу несколько генетических признаков). Все это способствует широкому использованию STR-локусов в криминалистическом ДНК-анализе и обуславливает создание на их основе баз данных ДНК.

В настоящее время наибольшее применение получили тетра- мерные STR-локусы, у которых длина повторяющейся единицы составляет 4 п.н.

В зависимости от строения STR-локусы разделяют на несколько групп. Например, простые повторы - это локусы, у которых повторяющиеся последовательности идентичны, например, локус FESFPS, аллельные варианты которого состоят из последовательности [АТТТ], повторяющейся в разных аллелях от 8 до 14 раз: [ATTTJ8-14.

Контрольные вопросы Расскажите о строении ДНК. Что такое нуклеотид, что он в себя включает? Что представляла собой модель ДНК, кто ее впервые предложил? Что такое денатурация? Что такое ренату рация? Как происходит деление молекулы ДНК? Дайте определения терминов аллель, локус, ген, генотип, гаплотип. Охарактеризуйте явление полиморфизма ДНК. Перечислите основные методы исследования ДНК.