<<
>>

Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР

  Сущность метода электрофореза. В настоящее время фракционирование и детекция флуоресцентно меченых продуктов ПЦР проводятся в автоматизированных системах (секвенаторах или генетических анализаторах).
В этих системах автоматизированы этапы электрофореза, детекции флуоресцентно меченых фрагментов ДНК и учета результатов электрофореза (рис. 4.11).

Рис. 4.11. Электрофорез различных фрагментов ДНК

4.              В              «              В              Е              F              Й

Рис. 4.11. Электрофорез различных фрагментов ДНК

Используя метод электрофореза, фрагменты ДНК различной длины могут быть фракционированы. Этот метод является важнейшим методом исследования ДНК и широко используется в криминалистическом ДНК-анализе.

Средой для электрофореза служит среда на основе полиакриламида, формирующая сетчатую структуру с величиной ячеек, соизмеримой с величиной молекулы ДНК. Исследуемые пробы ДНК вносят в среду для электрофореза и накладывают электрическое поле. Фрагменты ДНК (имеющие отрицательный заряд) начинают перемещаться к аноду (положительно заряженному электроду), испытывая сопротивление сетчатой среды геля. Чем короче фрагмент, тем меньшее сопротивление он испытывает и тем быстрее он движется (скорость миграции обратно пропорциональна логарифму

длины фрагмента). В результате электрофореза в среде образуются участки, содержащие фрагменты ДНК. Те области, которые располагаются ближе к аноду, соответствуют меньшим по длине фрагментам, а те, которые дальше, - большим (см. рис. 4.11).

В автоматизированных приборах электрофорез проводят до тех пор, пока все фрагменты ДНК не пересекут область детекции, которая располагается со стороны анода (рис. 4.12). В этой области среда электрофореза освещается лазером, который возбуждает свечение флуоресцентных меток продуктов ПЦР.

Цифровая камера фиксирует свечение меток, которое сохраняется на компьютере.

Электрофорез

РИС. 4.12. Схема электрофореза ДНК с автоматизированной детекцией флуоресцентных меченных продуктов

Энергия , Г Возбужденный Компьютер ' |' свет

’S-

РИС. 4.12. Схема электрофореза ДНК с автоматизированной детекцией флуоресцентных меченных продуктов П11Р

В результате фракционирования продуктов ПЦР STR-локусов ДНК на приборах получают первичные графические данные элек- трофореграмм. Эти данные представляют собой график измерений детектором интенсивности свечения флуоресцентных меток (рис. 4.13).

Для определения длины исследуемых фрагментов ДНК перед электрофорезом каждую исследуемую пробу смешивают с денатурирующим реагентом формамидом и специальным маркером - внутренним стандартом, содержащим смесь фрагментов известной длины (рис. 4.14).

Рис. 4.13. Первичные данные электрофореза продуктов ПЦР STR-локусов ДНК

Рис. 4.13. Первичные данные электрофореза продуктов ПЦР STR-локусов ДНК

alt="Рис. 4.14. Электрофорез фрагментов внутреннего стандарта" />

Рис. 4.14. Электрофорез фрагментов внутреннего стандарта

Фрагменты внутреннего стандарта содержат флуоресцентную метку, отличающуюся от флуоресцентных меток продуктов ПЦР. После электрофореза по расположению исследуемых фрагментов относительно фрагментов внутреннего стандарта, используя специальный компьютерный анализ, имеется возможность с высокой точностью установить величины исследуемых фрагментов ДНК.

Виды автоматизированных систем для электрофореза ДНК. В настоящее время существует два основных варианта автоматизированных систем: для электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле; для электрофорез в капилляре в среде специального полимера при денатурирующих условиях (капиллярный электрофорез).

Примером прибора, позволяющего проводить фракционирование и детекцию флуоресцентно меченых продуктов секвенирую- щих реакций по первому варианту является секвенатор ABI Prism 377 DNA Sequencer, производства фирмы Applied Biosystems, США. Примером приборов, работающих по второму варианту - ABI Prism 310 Genetic Analyzer, 3100 и 3130 Genetic Analyzer, производства фирмы Applied Biosystems, США (рис. 4.15).

Рис. 4.15. Генетический анализатор ABI Prism 3130 Genetic Analyzer

Рис. 4.15. Генетический анализатор ABI Prism 3130 Genetic Analyzer

Достоинством первого варианта электрофореза являются меньшие требования, предъявляемые к чистоте и качеству реактивов, меньшая стоимость анализа, проведение традиционных для ручного исследования процедур (приготовление полиакриламидного геля, подготовка образцов, их нанесение и т.д.)- Недостатком этого варианта является необходимость проведения значительного количества ручных операций, цикличность работы, требующая накопления объектов исследования.

Приборы капиллярного электрофореза лишены вышеприведенных недостатков, однако для них характерна более высокая стоимость анализа. Важным достоинством этих приборов является значительно более высокая скорость проведения электрофореза, что позволяет оперативно проводить анализ исследуемых объектов. Кроме этого, приборы капиллярного электрофореза могут быть встроены в единую автоматизированную линию исследования ДНК.

В настоящее время в отличие от традиционных систем электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле происходит активное развитие систем капиллярного электрофореза. Их следует рассматривать как основные приборы для криминалистических лабораторий ДНК-анализа.

Расшифровку первичных электрофореграмм проводят с помощью компьютерной программы GeneMapper ID, производства фирмы Applied Biosystems.

Интерпретация результатов электрофореза с помощью программы GeneMapper ID. Интерпретация результатов электрофореза с помощью программы GeneMapper ID заключается в установлении аллелей исследуемых STR-локусов.

Для установления аллелей при электрофорезе продуктов ПЦР исследуемых проб используют также пробу специального аллельного маркера или лэддера. Эта проба содержит фрагменты ДНК, соответствующие по последовательности и размерам всем встречающимся аллелям исследуемых локусов (рис. 4.16). Аллельный лэддер является внешним стандартом исследования. Аллельные лэддеры производятся изготовителями реактивов для амплификации.

Рис. 4.16. Электрофорез фрагментов аллельного маркера

Рис. 4.16. Электрофорез фрагментов аллельного маркера

С помощью компьютерной программы GeneMapper ID общая электрофореграмма пробы разделяется на электрофореграммы по отдельным флуоресцентным красителям. Сначала величина исследуемых фрагментов определяется по их расположению относительно фрагментов внутреннего стандарта. Далее полученные величины сравниваются с величинами фрагментов аллельного лэдде- ра. Допустимое отклонение исследуемых фрагментов от фрагментов аллельного лэддера не должно превышать ± 0,5 нуклеотида. При наличии совпадений фрагмент обозначается в соответствии с принятой номенклатурой аллелей, при отсутствии - обозначается как неопределенный.

Все фрагменты, обозначенные как неопределенные или локализующиеся выше и ниже крайних аллелей лэддера, должны быть проанализированы. При необходимости электрофорез повторяют.

При воспроизводимости результатов фрагменты, не совпадающие с фрагментами аллельного лэддера обозначают вручную в соответствии с принятой номенклатурой аллелей. В случае отсутствия воспроизводимости выявленные первоначально фрагменты являются неспецифическими и дальнейшему анализу не подлежат.

При анализе электрофореграмм могут быть обнаружены и другие неспецифические фрагменты, которые необходимо отличать от истинных аллелей. Часто выявляют так называемые статтеры (рис. 4.17) - фрагменты, которые короче истинного аллеля на одну повторяющуюся единицу (т.е. по уровню расположения соответствуют фрагменту лэддера, предшествующему истинному аллелю).

Для статтера характерны два признака, по которым его отличают от истинных аллелей, а также отличают гомозиготный профиль со статтером от гетерозиготного профиля: если появляется статтер, то он всегда ассоциирован с истинным аллелем (он короче истинного аллеля на одну повторяющуюся единицу); интенсивность статтера обычно не превышает 15 % интенсивности истинного аллеля, с которым он ассоциирован.

Другими, часто выявляемыми неспецифическими фрагментами являются так называемые N-фрагменты (рис. 4.18). Их появление связано с тем, что ДНК-полимераза обладает свойством достраивать во вновь синтезированную цепь ДНК один лишний нуклеотид.


200              210              230              2»              240              290              2U />


ogt;

О)

Рис. 4.18. Неспецифические явления — N-фрагменты

117 (N+Tj]ll8 W-nil

Рис. 4.18. Неспецифические явления — N-фрагменты

В результате этого свойства на основе матричной цепи ДНК синтезируются два типа фрагментов: N+1-фрагменты, которые длиннее на один нуклеотид, и N-фрагменты, соответствующие истинной длине исходной ДНК. Интенсивность N-фрагментов всегда ниже, чем N+1-фрагментов. Присутствие N-фрагментов обычно не усложняет установление истинных аллелей, однако следует особенно внимательно анализировать электрофореграммы локусов, аллели которых могут отличаться на одну пару оснований (например, аллели 9.3 и 10 локуса ТН01).

Особые неспецифические сигналы возникают в случае электрофореза проб с избыточным количеством продуктов ПЦР. В этом случае детекционная система прибора (цифровая камера) оказывается перенасыщенной, и становится невозможно корректно разделить флуоресцентные сигналы, получаемые в результате свечения разных флуоресцентных меток. В итоге на электрофореграммах отдельных флуоресцентных красителей детектируются фрагменты, равные по размеру (рис. 4.19).

Рис. 4.19. Неспецифические явления, возникающие в случае электрофореза проб с избыточным количеством продуктов ПЦР

Истинным фрагментом является только тот, у которого интенсивность свечения (высота пика) является большей. Сигналы других флуоресцентных красителей, равные по размеру, но меньшие по интенсивности следует считать неспецифическими. При неясных случаях следует повторить электрофорез с внесением меньшего количества продуктов ПЦР.

Фрагменты, которые были определены как статтеры или иные неспецифические фрагменты, в дальнейшем исследовании не учитывают.

Экспертный анализ результатов электрофореза начинают с изучения электрофореграмм контролей реакции амплификации и кон- тролей выделения ДНК.

Данные считаются достоверными, если: а) в отрицательных контролях реакции амплификации и контролях выделения ДНК отсутствуют амплифицированные фрагменты; б) профиль ДНК, выявленный в положительном контроле реакции амплификации, соответствует генотипу контрольной ДНК.

После оценки электрофореграмм контролей проводят анализ электрофореграмм исследуемых проб ДНК.

Сравнение установленных генетических признаков по STR- локусам и их интерпретация зависит от задач исследования. При исследовании объектов, содержащих ДНК одного лица, и сравнении их генетических признаков с генетическими признаками определенных лиц возможны два варианта: генетические признаки исследуемых объектов полностью совпадают. генетические признаки исследуемых объектов имеют различия.

В первом случае это означает, что исследуемые объекты могут иметь общий источник происхождения (один и тот же индивидуум или его однояйцовый близнец). Однако не исключается случайное совпадение генетических признаков неродственных лиц.

Контрольные вопросы Перечислите основные этапы исследования ядерной ДНК. Охарактеризуйте объекты исследования.

68

Что влияет на выбор того или иного метода выделения ДНК? С какими основными методами выделения ДНК вы познакомились? Что такое ПЦР? Охарактеризуйте три фазы цикла амплификации. Какие компоненты нужны, чтобы поставить ПЦР? Что такое праймеры? Что такое амплификатор? Какие амплификационные системы используются в настоящее время? Особенности мультипликационных систем. Каков принцип метода RT-PCR? Что такое зонд TaqMan? В каких целях применяют RT-PCR в судебно-генетических исследованиях? Что представляет собой калибровочный график для определения концентрации ДНК? Перечислите возможные варианты контроля ПЦР. Охарактеризуйте метод электрофореза. Что является средой для электрофореза? Как происходит электрофорез в автоматизированных приборах? Что такое внутренний стандарт? Какие варианты автоматизированных систем для электрофореза ДНК существуют в настоящее время? Перечислите достоинства и недостатки каждого варианта. Для чего нужна программа GeneMapper ID? Что такое лэддер? Охарактеризуйте термины статтеры, N-фрагменты. Когда полученные данные считаются достоверными? Как оценивают достоверность события?

<< | >>
Источник: И.В. Стороженко, А.Ю. Культин, В.Г. Никитаев, А.Н. Проничев, Е.Ю. Бердникович. Компьютерные технологии в судебно-генетической экспертизе. 2010

Еще по теме Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР:

  1. Технологическая схема исследования ядерной ДНК
  2. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР
- Авторское право - Аграрное право - Адвокатура - Административное право - Административный процесс - Акционерное право - Бюджетная система - Горное право‎ - Гражданский процесс - Гражданское право - Гражданское право зарубежных стран - Договорное право - Европейское право‎ - Жилищное право - Законы и кодексы - Избирательное право - Информационное право - Исполнительное производство - История политических учений - Коммерческое право - Конкурсное право - Конституционное право зарубежных стран - Конституционное право России - Криминалистика - Криминалистическая методика - Криминальная психология - Криминология - Международное право - Муниципальное право - Налоговое право - Наследственное право - Нотариат - Образовательное право - Оперативно-розыскная деятельность - Права человека - Право интеллектуальной собственности - Право собственности - Право социального обеспечения - Право юридических лиц - Правовая статистика - Правоведение - Правовое обеспечение профессиональной деятельности - Правоохранительные органы - Предпринимательское право - Прокурорский надзор - Римское право - Семейное право - Социология права - Сравнительное правоведение - Страховое право - Судебная психиатрия - Судебная экспертиза - Судебное дело - Судебные и правоохранительные органы - Таможенное право - Теория и история государства и права - Транспортное право - Трудовое право - Уголовное право - Уголовный процесс - Философия права - Финансовое право - Экологическое право‎ - Ювенальное право - Юридическая антропология‎ - Юридическая периодика и сборники - Юридическая техника - Юридическая этика -